RESUMO
O objetivo deste estudo foi investigar o papel do fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) na concentração de 300ng/ml na taxa de proliferação e adesão de células derivadas da granulação óssea humana a fragmentos radiculares periodontalmente comprometidos. Na primeira etapa do estudo, foi estabelecida cultura primária de células da granulação óssea de dois pacientes adultos, sistemicamente saudáveis, não fumantes. Após a expansão celular, as células foram caracterizadas para determinação do fenótipo por meio de ensaios de viabilidade celular, MTT, ensaio de atividade de fosfatase alcalina, ensaio de mineralização e caracterização imunohistoquímica por meio de citometria de fluxo (segunda etapa). Na terceira etapa do estudo, os efeitos da adição de PDGF-BB recombinante humano na concentração de 300ng/ml na taxa de proliferação e adesão de células derivadas da granulação óssea a superfícies radiculares periodontalmente comprometidas foram investigados. A taxa de proliferação celular estimulada pelo PDGF-BB (grupo teste) ou pelo meio de cultura (grupo controle) foi investigada por meio de contagem de células viáveis nos frascos de cultura após 1, 3, 5 e 7 dias do cultivo celular. Foram obtidos 30 fragmentos dentários a partir de dentes extraídos por razões periodontais. Os fragmentos foram raspados com curetas Gracey e condicionados com solução em gel de EDTA a 24% durante 3 minutos, lavados com solução de soro fisiológico, secos e posicionados em placas de 24 poços. Foram incubadas sobre os fragmentos tratados 1x104 células GO por 24 horas, seguido por fixação e preparo para análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O número de células aderidas sobre os fragmentos foi analisado nas fotomicrografias. O padrão de crescimento das células GO foi compatível com células ósseas, com modificação do padrão do crescimento com o aumento do número de passagens. Houve atividade de fosfatase alcalina em meio osteogênico e convencional, com pico máximo aos 7 dias e atividade de mineralização estimulada ou não por meio osteogênico, com pico máximo aos 21 dias. A análise por meio de citometria de fluxo demonstrou que as células GO não expressaram CD105 e CD166 na 14a passagem, indicando sua diferenciação celular avançada nesse período. A adição de rhPDGF-BB resultou em mudança na taxa de proliferação celular, observando-se pico máximo de crescimento aos 7 dias, com diferenças estatisticamente significantes (p < 0.005; ANOVA post hoc Tukey) em relação aos períodos de 1, 3 e 5 dias. O ensaio de MTT demonstrou maior viabilidade celular no período de 48 hs, comparativamente aos períodos de 24 e 72 horas, quando a densidade óptica celular diminuiu de forma significativa (p< 0.05; Friedmann pósteste Dunn). No ensaio de adesão celular, pode-se observar que a adição de rhPDGFBB aumentou significativamente o número de células aderidas aos fragmentos dentários (p< 0.05; teste t não pareado com correção Welch), com alteração da morfologia celular. Esses resultados sugerem que as células GO tem características compatíveis com linhagem de células osteoblásticas, de fenótipo mais diferenciado após a 12a passagem. A adição de rhPDGF-BB (300ng/ml) resulta em aumento da taxa de proliferação das células GO e do número de células aderidas a fragmentos radiculares, indicando que, nesta concentração, o fator de crescimento é citocompatível, favorecendo a proliferação e adesão celular.(AU)
The goal of this study was to investigate the effects of recombinant human platelet derived growth factor (rhPDGF-BB) at the concentration of 300ng/ml in the proliferation and adhesion of human bone granulation cells to periodontally diseased root fragments. At the first stage of the study, the granulation tissue existent in healing sockets (21 days after its creation) was collected from two systemically healthy nonsmoking adults to the establishment of primary culture. The in vitro properties of bone granulation (BG) cell lineage were characterized by cell viability, MTT, alkaline phosphatase activity and mineralization assays. The effects of culture medium (control) and rhPGDF-BB 300ng/ml (test) in the proliferation and adhesion of BG cells were investigated. The rate of BG cells proliferation was investigated by the number of viable cells present at 1, 3, 5 and 7 days after platting. Thirty root fragments were obtained from teeth extracted for periodontal reasons. Root fragments were scaled and root planed, conditioned with EDTA 24% for 3 minutes, rinsed in saline solution, air-dryed and positioned in 24-well plates. Each fragment was seeded with 104 BG cells, fixated after 24 hours and prepared for analysis in SEM. The number of cells adhered to the fragments was analysed in photomicrographies. BG cells growth pattern was compatible with osteogenic cell lineage, showing modification with the increasing number of cell passage. GO cells expressed alkaline phosphatase activity in conventional and osteogenic culture medium, with maximum peak at 7 days, as well as mineralization activity stimulated or not by osteogenic or non-osteogenic culture medium, with maximum peak at 21 days. The analysis by flow cytometer showed that BG cells have not expressed CD105 and CD106 at the 14th passage, indicating its advanced cell differentiation. The addition of rhPDGF-BB resulted in modification of proliferation rate, with maximum peak observed at 7 days, significantly different from 1-, 3- and 5-day periods (p< 0.005; ANOVA post hoc Tukey). MTT assay showed greater cell viability after 48 hours than after 24 and 72 hours, when optical density has significantly diminished (p< 0.05; Friedmann post hoc Dunn). At cell adhesion assay, it could be observed that the adhesion of rhPDGF-BB has significantly increased the number of cells adhered to root fragments (p< 0.05; unpaired t test with Welchs correction), and alterations in cell morphology. These results suggest that BG cells present in vitro characteristics compatible with osteoblastic cell lineages, with a more differentiated phenotype after the 12th passage. The addition of rhPDGF-BB (300 ng/ml) results in increase of the rate of BG cell proliferation and in the number of cells adhered to root fragments, indicating that, at this concentration, the growth factor is compatible with BG cells and favors cells proliferation and adhesion.(AU)
Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Adesão Celular/efeitos dos fármacos , Proliferação de Células/efeitos dos fármacos , Tecido de Granulação/citologia , Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas/farmacologia , Raiz Dentária/citologia , Alvéolo Dental/citologia , Análise de Variância , Regeneração Óssea/efeitos dos fármacos , Contagem de Células , Células Cultivadas , Citometria de Fluxo , Imuno-Histoquímica , Microscopia Eletrônica de Varredura , Reprodutibilidade dos Testes , Estatísticas não ParamétricasRESUMO
O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária de células derivadas da granulação óssea (GO) de seres humanos para determinar seu padrão de crescimento in vitro e determinar os efeitos biológicos de três membranas reabsorvíveis feitas de colágeno (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) em culturas de fibroblastos gengivais humanos (FGH) e células da granulação óssea (GO). Foram coletadas amostras de tecido ósseo presente no alvéolo de cicatrização de dois pacientes adultos saudáveis sistemicamente com indicação de cirurgia periodontal regenerativa pela técnica do enxerto ósseo em neoformação. Imediatamente após a coleta, as amostras foram transportadas ao laboratório de cultura de células para estabelecimento da cultura primária. As células foram cultivadas em atmosfera úmida, contendo 5% CO2 a 37oC. A curva de crescimento das células foi determinada por meio de contagem de células viáveis. Após a caracterização da curva de crescimento, foram realizadas a caracterização da amostra por meio de determinação da atividade de fosfatase alcalina e de mineralização. Posteriormente, os efeitos de três diferentes tipos de membranas colágenas sobre a proliferação de células GO e FGH foram investigados por meio do teste MTT. As amostras foram divididas em oito grupos: (1) células FGH em meio DMEM (C-FGH); (2) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-FGH); (3) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-FGH); (4) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana ColaTape (CT-FGH); (5) células GO em meio DMEM (C-GO); (6) células GO em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-GO); (7) células GO em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-GO); (8) células GO em meio DMEM condicionado com membrana CollaTape (CT-GO). O teste de proliferação celular mostrou que houve aumento significativo (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas) do número de células vitais presentes na cultura nos dias 3 (90,8%)...
The aim of this study was to establish primary culture of cells derived from human bone granulation tissue (GO) in order to determine its growth pattern in vitro and the biological effects of three absorbable collagen membranes (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) in human gingival fibroblasts (FGH) and human bone granulation (GO) cell cultures. Samples of bone tissue present at healing sockets of two systemically healthy adults with indication of periodontal regenerative therapy by the newly forming bone were collected. Immediately after, samples were transported to the laboratory of cell culture to the establishment of primary cultures. Cells were cultivated in humid atmosphere with 95% CO2 at 37oC. Cells growth pattern were determined by counting of viable cells. After characterization of growth pattern, samples were characterized according to alkaline phosphatase activity and mineralization detected by alizarin red. Afterwards, the effects of three different types of collagen membranes on GO and FGH cells were investigated by MTT test. Samples were divided into eight groups: (1) FGH cells in DMEM (C-FGH); (2) FGH in DMEM conditioned by GenDerm® membrane (GD-FGH); (3) FGH in DMEM conditioned with BioGide® (BG-FGH); (4) FGH in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-FGH); (5) GO cells in DMEM (C-GO); (6) GO cells in DMEM conditioned by GenDerm® (GD-GO); (7) GO cells in DMEM conditioned by BioGide® (BG-GO); (8) GO cells in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-GO). Cell proliferation test showed a significant (p< 0.05; ANOVA for repeated measures) increase in the number of vital cells present in the culture at days 3 (90.8%), 5 (132.50%), 7 (137.50%) and 10 (227.50%) compared to control (dia 0). It was observed alkaline phosphatase activity and mineralization in vitro. There was an increase in the number of FGH and GO viable cells at all groups (p< 0.05; ANOVA for repeated measures). Greater proliferative effect at FGH and GO cells at GD and CT...
